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产品服务

Sequencing services

RNA-Seq

        RNA-Seq,对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的mRNA进行高通量测序,可以提供定量分析,检测基因表达水平差异。


技术优势

数字化信号:测序直接获得序列,无背景噪音,无交叉杂交;可鉴别序列间单个碱基的差异;

高通量:一次测序得到千万条以上的序列;

检测阈值宽:跨越6个数量级的宽检测阈值,从几个到数十万个拷贝精确计数;

良好的重复性:深度测序保证了抽样随机性,重复性非常好,无需重复实验;

高灵活性 :依据客户需求,提供不同测序平台服务。

 

产品应用

医学上的应用方向——

 

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农学上的应用方向 ——

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研究内容

标准信息分析:

1)测序数据过滤;

2)参考基因组比对;

3)基因表达量分析;

4)基因表达量聚类分析;

5)时间序列分析(3个或3组及以上样品);

6)差异表达基因检测;

7)差异表达基因维恩分析;

8)差异表达基因层次聚类分析;

9)差异表达基因GO功能分析和网络图;

10)差异表达基因Pathway功能分析和网络图;

11)差异表达基因转录因子编码能力预测和网络图(植物、动物样品);

12)差异表达基因蛋白互作分析;

13)差异表达基因中的真菌致病基因预测(真菌样品);

14)差异表达基因中的植物抗病基因预测(植物样品)

高级信息分析:

1)基因共表达网络分析(15个及以上样品,不包含在标准执行周期内)

定制化信息分析:

1. 可结合客户的需求,协商确定定制化信息分析内容。


医学案例:BGISEQ-500 RNA-Seq抗乙肝病毒免疫机制研究

案例描述:

        全球有乙肝病毒(HBV)感染而导致的乙肝患者超过3.5亿,其中约1/3在中国。除了接种疫苗,目前广泛使用抗病毒天然免疫细胞因子IFNα(I型干扰素)治疗,但效率低,其分子机制尚不清楚。

       本研究通过高通量小RNA干扰筛选、特异性敲除基因的小鼠模型、BGISEQ-500 RNA-Seq等技术手段,揭示了甲基转移酶SETD2分子直接催化信号蛋白STAT1甲基化修饰在IFN的抗病毒免疫中起关键作用的新机制,为病毒感染性疾病的治疗提供了新靶点。

研究结果:

1、SETD2经SET域促进STAT1活化,从而提高干扰素诱导的抗病毒功能:

       HepG2细胞中敲除SETD2,产生出3个SETD2-KO细胞系,呈现出SETD2表达缺失和总的H3K36me3水平下降(图F),与对照HepG2相比,都表现出干扰素诱导的STAT1磷酸化作用受损(图G)。观察干扰素处理的SETD2-KO HepG2细胞,IFNAR1/R2或 STAT1上游信号分子的表达没有显著差异。通过RNA-Seq分析,发现一系列ISGs响应干扰素刺激,在SETD2-KO细胞比HepG2 WT细胞表达更低(图H)。qRT-PCR分析确定干扰素刺激后在SETD2-KO细胞中两个ISG表达降低,包括ISG15 和MX2(图I)。所以,在干扰素刺激下,SETD2提高STAT1磷酸化作用和ISG表达。

                                                                       图片8图片9

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图1 SETD2促进干扰素诱导的STAT1 磷酸化和 ISGs 表达

2、SETD2选择性促进H3K36me3修饰的ISGs表达

       利用RNA-Seq,在SETD2-KO细胞、STAT1-K525A-Re细胞、STAT1-KO细胞以及对照的HepG2 细胞在干扰素刺激下6小时(图2A)。干扰素刺激后对照HepG2细胞中222个基因被诱导,SETD2-KO 细胞、STAT1-K525A-Re细胞和STAT1-KO 细胞,与对照HepG2细胞相比,分别有89、128和180个基因显著性下调(图2B)。GO富集分析显示SETD2-KO 细胞和 STAT1-K525A-Re细胞中表达更低的基因被归类于病毒的防御反应或I型干扰素通路相关基因(图2C)。STAT1-KO细胞在干扰素刺激下下调的180个基因,其中有40%的基因在SETD2-KO细胞在干扰素刺激下也表达更低,包括SETD2促进一系列的STAT1依赖的ISG(图2D)。另外,在干扰素刺激后的SETD2-KO 细胞和STAT1-K525A-Re细胞中,75个基因表达更低,包括有抗病毒功能的ISGs,比如ISG15、ISG20、MX2等(图2D和2E)。进一步确定了SETD2介导的ISGs调控是在很大程度上依赖于在介导STAT1 K525单甲基化作用中它起到的作用。

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图2 SETD2选择性催化一些ISGs的 H3K36me3 修饰

参考文献

Chen K, Liu J, Liu S, et al. Methyltransferase SETD2-Mediated Methylation of STAT1 Is Critical for Interferon Antiviral Activity. Cell. 2017 Jul 27;170(3):492-506.e14.

 

农学案例:BGISEQ RNA-Seq作物高效利用氮肥调控机制研究

案例描述:通过选育半矮化作物,极大地提高了绿色革命品种谷物的产量,但因使用过多无机氮肥而导致环境恶化日益加剧。为加强全球粮食安全及可持续发展,提高作物氮利用效率的需求日益迫切。因此,亟需深入了解作物生长,氮同化、碳固定的共同调节机制。

研究方法:以NJ6 (SD1)为对照,对36个含有sd1的籼稻品种分析NH4+的利用率。再以NJ6为轮回亲本与一个高NH4+吸收率品系NM73杂交创建BC1F2群体,通过QTL定位、图位克隆等技术获得氮肥高效利用的关键基因。分析关键基因启动子的三种SNP分型,筛选不同型别影响作物产量的潜在联系。

研究结果:

1、GRF4-DELLA相互平衡作用调节植物的生长和代谢。GRF4是生长调节因子,调节促进植物氮代谢和稳态,也协调促进植物碳代谢和生长,而DELLA生长阻遏物抑制这些过程。

2、半矮化作物中,在适度的氮素水平下增加GRF4的表达,GRF4-DELLA平衡机制偏向于GRF4的促进作用,从而利于氮、碳的吸收,增加叶、茎的宽度,但对高度影响很小。因此,GRF4表达增加改善氮素吸收效率的同时,不影响半矮化性状,能进一步提高作物产量。

结果展示:

通过基于BGISEQ平台的RNA-Seq和ChIP-seq两项技术,解析GRF4作用的分子机制,证明GRF4是激活下游参与氮素吸收和氮素同化的相关基因。ChIP-Seq揭示了潜在的GRF4靶识别位点,其中主要是多个氮代谢基因启动子共有的GGCGGC-motif。

GRF4与GIF1(GRF-interacting factor 1)复合体结合包含GCGG-motif的启动子,促进氮素同化吸收。SLR1(属于DELLA家族)在该途径中可抑制GRF4与GIF1的相互作用,导致氮素利用率降低。同时,GRF4还可以促进碳同化吸收相关基因的表达。

 

图

图3 GRF4调控多种氮代谢基因的表达

参考文献

Li S, Tian Y, Wu K, et al. Modulating plant growth-metabolism coordination for sustainable agriculture. Nature. 2018 Aug;560(7720):595-600.



                                               图3第一个图HBRR-VS-UHRR图3第二个图HBRR2-VS-UHRR2_PossionDis_Method_network

      图3第三图 第二排第一个HBRR2-VS-UHRR2图3第四个图 第二排第二个HBRR1-VS-UHRR1图3第五个图 第二排第三个Coexpression

图1 GO、KEGG、蛋白互作网络、转录因子和WGCNA的基因共表达等五大特色关系网络图

                            图4 第一个图 第一排左图4 第二个图 第一排右blue

                           图4 第三个图 第二排左Modules_gene_black图4 最后一个图 第二排右

图2 共表达基因模块与样品的相关性总览图,单个模块的基因共表达网络图、GO和KEGG功能注释


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表1 BGISEQ-500 RNA-Seq样品判定标准

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Q1:RNA-Seq是否需要做生物学重复?如果需要,一般要多少个重复样本?

是的,2011 年 7 月 Hansen[1]发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性,与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。生物学重复实验,可以在很大程度上消除样本的个体差异、系统平台差异,能更准确地检测差异基因。如果不设生物学重复,高影响因子的杂志可能会遭编辑质疑。不建议2个生物学重复是因为,如果两者结果不一致,无法确定以哪个数据为参考。3个生物学重复,如果出现1个结果不一致的,可以取另外2个的结果。

Q2:RNA-Seq必须要有参考基因组序列吗?

不是必须要有参考基因组序列,但一定要有参考序列,如unigene序列、mRNA序列、CDS序列等可以作为参考序列。也可通过参考有基因组序列的近缘物种的基因注释信息来完成相应的标准信息分析,不过此种方法并不推荐。

Q3:RNA-Seq如果没有参考序列怎么解决?

推荐做转录组de novo组装获得unigene作为RNA-Seq参考序列。需要注意的是,要把所有做RNA-Seq的样品,都混合成一个样品,做转录组。

Q4:RNA-Seq推荐测序数据量与基因组大小有关吗?

RNA-Seq推荐的测序数据量,主要与基因数量有关,不同物种基因组大小相差比较大,但是编码基因的数量相差并不大,一般物种在3万左右。所以对于一般物种的RNA-Seq数据量,10M clean reads是足够的。一般HiSeq平台推荐10M clean reads数据量,BGISEQ-500平台,为了给研究者更准确全面的数据结果,提供20M clean reads,而价格比HiSeq平台10M clean reads数据量还低。

Q5:有些观点认为RNA-Seq测序策略是SE100,有必要测这么长吗? PE测序是不是会比SE测序更好?

没有必要,SE50足够。做RNA-Seq,只要将得到的reads比对到参考基因集,得到基因ID就可以了,不需要那么长,因为不需要做组装,也不需要做定性分析。文献支持:康奈尔大学维尔医学院的研究人员在Genome Biology杂志上发表文章[2]认为对于差异表达分析而言,读长并非越长越好。研究人员认为,在RNA-seq研究中使用什么样的读长,这要取决于研究的最终目的。如果只需要差异表达基因,那么50 bp的单端读取就够了。与100 bp的双端读取相比,使用50 bp的单端读取能够节省成本、时间。

Q6:测序后有何验证方法?

实验验证的方法最常见的是通过实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)技术来验证测序结果。还有FISH(原位荧光杂交)、微阵列芯片技术、Northern blot等。 功能验证一般是基因敲除、敲低或过表达,转基因等。

Q7:BGISEQ-500 RNA-Seq有没有发布demo数据?

已发布一个UHRR人标准品下机数据并共享了数据结果和分析方法。网址:http://lightingassoc.com/science/cat-91-588-1464.html。


参考文献

1. Kasper D Hansen, Zhijin Wu, et al. Sequencing technology does not eliminate biological variability. Nature Biotechnology. 2011. 29(7): 572–573.

2. Chhangawala S, Rudy G, Mason CE, et al. The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection. Genome Biology. 2015 Jun 23;16:131.


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